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革兰氏染色法详解:最基本的微生物实验

作者:     来源:     发布时间:2016-08-01 21:34:37

 一、目的要求

    了解革兰氏染色的原理,学习并掌握革兰氏染色的方法。
 
    二、基本原理
    革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(番红)的颜色,因此呈现红色。
    革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料(basic dye)初染液;媒染剂(mordant);脱色剂(decolorising agent)和复染液(counterstain)。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样,而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落,碘(iodine)是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色,不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,从而将细胞区分成G+和G-两大类群,常用的复染液是番红。
 
革兰氏染色实验的具体操作是怎样的?
1.火焰外焰固定细菌的涂片; 
2.初染:加饱和结晶紫染色1min;水洗; 
3.媒染:加卢戈氏碘液染色1min;水洗; 
4.脱色:加95%酒精脱色30sec(或至无紫色脱下)水洗; 
5.复染:加稀释石碳酸复红染色30-60sec,水洗后晾干玻片,镜检。
 
当然目前有先进的革兰氏染色机可以代替手工操作。
 
    三、器材
    大肠杆菌,枯草芽孢杆菌;
    革兰氏染色液,载玻片,显微镜等。
 
    四、操作步骤
    1.涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚),干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。
    2.染色
    (1)初染 加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗。
    (2)媒染 滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗。
    (3)脱色 将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20—30秒钟,立即用水冲净酒精。
    (4)复染 用番红液染1—2分钟,水洗。
    (5)镜检 干燥后,置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。
    (6)同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片,作革兰氏染色对比。
    革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。
    图Ⅳ-2示革兰氏染色过程。
 
    五、实验报告     
    1.结果
    在你所作的革兰氏染色制片中,大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色?它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌?
    2.思考题
    (1)作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚?其染色成败的关键一步是什么?
    (2)当你对一株未知菌进行革兰氏染色时,怎样能确证你的染色技术操作正确,结果可靠?
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